Рис. 1. Степень ингибирования трипсина и химотрипсина ингибиторами в составе щелочного и кислого экстрактов:
 

Соевые ингибиторы термолабильны. Практически полная их инактивация (93—95 %) достигается при прогреве экстрактов в течение 15 мин до температуры 90 °С. Экстракт, полученный после прогрева, можно направить на получение белкового изолята.

Для выделения ингибиторов была выбрана кислотная экстракция, поскольку процесс предполагается проводить в ходе получения белкового изолята. Из кислотного экстракта получают изолят лучшего качества, чем из щелочного. Щелочной экстракт сильнее окрашен, в нем возможно образование токсичных продуктов — оснований Шиффа. Выделение ингибиторов в очищенном виде проводили по следующей схеме. Экстракт из белого лепестка концентрировали в 2,5 раза на ультрафильтрационной ячейке (мембрана с размером пор 100 кДа). Концентрат направляли на получение белкового изолята, а пермеат — на выделение ингибиторов.

Молекулярная масса высокомолекулярных соевых белков превышает 50 кДа. Молекулярная масса соевых ингибиторов Кунитца 20—25 кДа, ингибиторов Баумана-Бирка 6—10 кДа. В результате ультрафильтрации на мембране с размером пор 100 кДа 75—80 % ингибиторов переходят в пермеат.

На следующем этапе для разделения ингибиторов проводили ультрафильтрацию пермеата с использованием мембраны с размером пор 20 кДа. Установлено, что пермеат после мембраны содержит только ингибитор Баумана-Бирка, а концентрат — оба ингибитора.

Полученные концентрат и пермеат исследованы методом гель-хроматографии на колонке, заполненной сефадексом 0-50 (диапазон разделяемых молекулярных масс от 1,5 до 30 кДа). На хроматограмме концентрата получены два ярко выраженных пика, по молекулярным массам соответствующих ингибиторам Кунитца и Баумана-Бирка (рис. 2).

Рис. 2. Гель-хроматограмма концентрата, полученного на мембране 20 кДа:
1 — проба концентрата после мембраны; 2, 3, 4 — соответственно пробы, полученные после 1, 2 и 3-й диафильтрации концентрата

На хроматограмме пермеата получен один выраженный пик, соответствующий ингибитору Баумана-Бирка (рис. 3).

Содержание ингибитора Баумана-Бирка в концентрате до и после диафильтрации
 (в единицах оптической плотности, соответствующей пику на хроматограмме)

Ингибитор Кунитца растворим в воде, а Баумана-Бирка — в спирте. Из промытого диафильтрацией концентрата ингибитор Кунитца осаждали этиловым спиртом. Оптимальный гидромодуль для данного процесса 1 : 1. Выделение ингибитора Баумана-Бирка из пермеата проводили путем осаждения ацетоном. Оптимальный гидромодуль 1 : 2.

Осадки были высушены и проверены на ингибирующую активность с помощью контрольного гидролиза. При добавлении ингибитора Кунитца наблюдалось ингибирование трипсина на 40 %, а ингибирование химотрипсина практически отсутствовало. При добавлении ингибитора Баумана-Бирка имело место заметное ингибирование как трипсина, так и химотрипсина. Полученные результаты соответствуют литературным данным.

При получении белкового изолята возможен возврат пермеата на стадию экстракции после ультрафильтрации с использованием мембраны 100 кДа. Этот прием обеспечивает увеличение белковых веществ в экстракте без потери питательных свойств белкового изолята и накопления токсичных продуктов. Для кислотной экстракции возможен 4-кратныгй возврат, а для щелочной — 2-кратный. Такое решение применимо и для выделения соевых ингибиторов, поскольку они извлекаются симбатно с белковыми веществами. Выбор кислотной экстракции обусловлен, в том числе, большей кратностью возврата пермеата на стадию экстракции.

Изучение других возможных путей выделения ингибиторов в промышленных условиях, а также свойств полученных ингибиторов будет предметом дальнейших исследований.

Реализация предложенной технологии переработки позволит в 3—4 раза снизить ХПК сточных вод производства соевого изолята и получить ценные продукты.