Варьируя условия проведения процесса — скорость протока, концентрацию субстрата, иммобилизуемую активность, можно добиться 100%-й конверсии различных фосфорорганических субстратов. Полученные биокатализаторы можно высушить и регидратировать с сохранением 97 % исходной активности.

Поскольку в процессе ферментативного гидролиза ФОС выделяются кислые продукты, рН реакционной смеси снижается вместе с ОРН-активностью, так как оптимум действия фермента НiS₆—ОРН находится в щелочной области.

В последнее время большое внимание уделяют флуоресцентным белкам, особенно гибридным аналогам зеленого флуоресцентного белка (GFP), которые часто используют в качестве гибридных партнеров различных белков для идентификации их локализации внутри клетки или на хроматографическом носителе. Флуоресценция GFP зависит от рН раствора, однако ее интенсивность практически не меняется в области рН 5,5—10. Кроме того, для GFP характерен долгий отклик на возбуждение флуоресценции.

Недавно был создан новый класс рН-чувствительных флуоресцентных белков (deGFP), аналогов GFP. Данные белки обратимо изменяют флуоресцентные свойства в зависимости от рН раствора.

Нами был создан гибридный белок, состоящий из молекул ОРН и deGFP4, соединенных спейсером из пяти последовательно соединенных остатков аргинина и аланина, а также гексагистидиновой последовательности на N-конце молекулы белка (N—Нis₆—deGFP4—(RA)₅—ОРН). Цель создания данного гибридного белка — объединение в его составе функций органофосфатгидролазы, осуществляющей гидролиз ФОС, и свидетеля протекания данного процесса, изменяющего интенсивность флуоресценции в зависимости от смещения рН реакционного раствора.

Гибридный белок был синтезирован в клетках Е. coli при 28 °С на богатой питательной среде. По сравнению с исходным белком His₆—ОРН и аналогом, описанным в литературе, выход растворимой формы гибридного белка оказался выше в  ~2 раза и 25 раз соответственно. Повышенное содержание данного белка в растворимой форме внутри клеток Е. coli по сравнению с белком His₆—ОРН позволило использовать эти микроорганизмы для создания иммобилизованного препарата, применяемого на 2-й стадии процесса утилизации ФОС.

При исследовании каталитических характеристик препарата гибридного белка установлено, что оптимум его ОРН-активности практически совпадает с оптимумом действия His₆—ОРН. Для гибридного белка наблюдалось существенное увеличение константы Михаэлиса К_т и снижение максимальной скорости реакции гидролиза субстрата параоксона V_max по сравнению со значениями К_т и V_max, характерными для His₆—ОРН. Изучение структуры молекул димера и мономера ОРН и гибридного белка методами молекулярного моделирования, а также исследование процессов термоинактивации белков His₆—ОРН и Нis₆—deGFP4—(RA)₅—ОРН позволили предположить, что снижение сродства гибридного белка к параоксону связано с конформационными изменениями в активном центре ОРН-субъединицы гибридного белка.

Показано, что в активном центре гибридного белка происходит сильное раскрытие гидрофобных карманов, образующих центр связывания субстрата, что, очевидно, приводит к изменению К_т фермента в пользу субстратов с более объемными заместителями у фосфорного центра, чем у параоксона. К числу таких субстратов относятся многие ФОС, например рабонд, хлорфенвинфос, фентион, кумафос, диазинон, хлорофос. Таким образом, полученный гибридный белок можно применять на 1-й стадии процесса уничтожения ФОС.

Возможность контроля процесса гидролиза ФОС посредством определения флуоресценции гибридного белка продемонстрирована на примере субстрата параоксона. При гидролизе 40 мМ параоксона происходит снижение рН реакционной смеси на 0,2 ед., сопровождающееся разгоранием флуоресценции на 2 %.

Для утилизации продуктов ферментативного разложения ФОС использовали иммобилизованный биокатализатор на основе клеток E. coli, содержащих полипептид со свойствами органофосфатгидролазы. Носителем служил макропористый криогель. Применение иммобилизованных клеток в такой системе имеет ряд преимуществ: