Разработка биосенсора на основе иммобилизованных клеток Photobacterium phosphoreum для обнаружения экотоксикантов в водных средах/Biosensor Development Using Photobacterium Phosphoreum Immobilized Cells to Detect Ecotoxic Agents in Aquatic Environments

Разработка биосенсора на основе иммобилизованных клеток Photobacterium phosphoreum для обнаружения экотоксикантов в водных средах

Холстов А. В., Сенько О. В., Исмаилов А. Д., Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Москва, Россия
Ефременко Е. Н., Институт биохимической физики им. Н. М. Эмануэля Российской академии наук, Москва, Россия

Проблема контроля качества поверхностных вод приобретает все большее значение. Источники загрязнения разнообразны по происхождению, составу и содержанию токсичных веществ (табл. 1).

Некоторые источники загрязнения и содержание токсичных веществ

Источник загрязнения	Токсичное вещество	Содержание токсичного вещества, мас. %
Битум	Бензол	1,3
Ртутные лампы отработанные, люминесцентные ртутьсодержащие трубки и брак	Ртуть	до 0,2
	Свинец	2,6
	Медь	до 0,2
Свинцовые пластины отработанных аккумуляторов	Свинец	97
Свинцовые пластины отработанных аккумуляторов	Сурьма	1
Отходы хлорорганических и фосфорорганических производств	Хлорорганические и фосфорорганические соединения	до 75
Поверхностный сток с сельскохозяйственных полей	Пестициды	10
Отработанные полимерные материалы	Поливинилхлорид и его производные	до 50

Поскольку визуализация загрязняющих веществ наступает при концентрациях, значительно превышающих предельно допустимые, необходимо проведение постоянного мониторинга качества воды и сбор информации в режиме реального времени. В связи с этим разработка способа экспресс-анализа экотоксикантов в водных средах, позволяющего определять элементный состав оперативно и дистанционно, — весьма актуальная задача.

Физико-химические методы контроля состояния водных объектов достаточно чувствительны, обеспечивают необходимую точность измерений, но требуют подготовки проб для проведения анализа и применимы преимущественно в лабораторных условиях. Биологические методы контроля предусматривают использование сенсоров на основе клеток микроорганизмов. Благодаря видовым особенностям некоторые из них весьма быстро реагируют на присутствие экотоксикантов в окружающей среде. Для регистрации этой реакции требуется простое оборудование, что позволяет проводить анализ с помощью мобильной лаборатории поблизости от водного объекта. Микробиологические культуры, на основе которых возможно создание биосенсоров, описаны в табл. 2.

Вид микроорганизма	Характерные представители вида	Природа аналитического сигнала
Светящиеся бактерии (фотобактерии)	Photobacterium phosphoreum Vibrio fischeri Vibrio harveyi	Бактериальная люциферазная система

Система биодетекции представляет собой комбинированный комплекс, состоящий из фотобактерий (излучателя света) и фотодетектора. Биосенсоры способны обнаружить широкий спектр токсичных соединений при весьма низких концентрациях (табл. 3).

Экотоксикант	Нижний предел обнаружения, г/л
Хлорорганические и фосфорорганические соединения	5·10⁻⁶
Углеводороды нефти	7,5·10⁻⁵
Ионы тяжелых металлов	1·10⁻⁵
Производные фенола	6·10⁻⁶

В настоящее время разрабатываются биосенсорные системы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов, позволяющие проводить анализ в проточных системах, т. е. без непосредственного отбора пробы из водного объекта. Возможно длительное использование одного биосенсора, если в потоке отсутствуют экотоксиканты, и наблюдение кумулятивного эффекта.

Принципиальная схема получения иммобилизованного биокатализатора на основе криогеля ПВС представлена на рис. 1.

Рис. 1. Схема получения иммобилизованного биокатализатора на основе криогеля ПВС

На основе исследований реологических свойств криогелей готовили 13%-е исходные растворы полимера.

Для получения биосенсора клетки Р. phosphoreum штамм NZ-11-D выращивали в течение 22 ч на питательной среде в глубинной культуре до концентрации (2—5)·10⁹ кл/мл. Затем суспензию клеток осаждали центрифугированием (5 000 об/мин, 20 мин), ресуспендировали в Na-фосфатном буфере (рН = 7,6), содержащем 2 % NaСl, и снова осаждали на центрифуге (5 000 об/мин, 20 мин). Далее осадок клеток ресуспендировали в 13%-м водном растворе ПВС из расчета содержания биомассы, равного 10 %. Суспензию клеток раскапывали по 96 лункам микропланшетов и замораживали при температуре −80 °С. В замороженном состоянии клетки выдерживали не менее 15 ч, затем медленно размораживали при +8 °С. Полученные гранулы использовали при проведении исследований.

В кювету прибора вносили 1 мл 2%-го раствора NaСl, 1 гранулу биокатализатора (150 мг) и 10 мкл раствора экотоксиканта. Время инкубации 5 мин. Свечение контрольных образцов принято за 100 %. Результаты модельных экспериментов по определению зависимости интенсивности свечения от концентрации С раствора токсичных соединений представлены на рис. 2.

Чувствительность биосенсора на основе иммобилизованных клеток не меньше, чем свободных клеток. Мониторинг состояния биосенсора свидетельствовал о том, что процесс иммобилизации существенным образом не влияет на активность люциферазной системы. Система на основе такого биосенсора пригодна для анализа экотоксикантов в потоке. Исследования показали, что в этом случае диффузия клеток из пор носителя в окружающую среду не превышает 1 %.

В силу высокой чувствительности, быстродействия и стабильности разработанный иммобилизованный биосенсор для биолюминесцентного анализа экотоксикантов в дискретном и непрерывном режимах можно применять для экспресс-детекции загрязняющих веществ в водных акваториях и промышленных сточных водах, а также для контроля за процессами биотрансформации и деградации токсинов.